細胞凋亡檢測試劑盒的兩種常用技術：TUNEL技術/Annexin V/PI檢測法

　　細胞凋亡檢測試劑盒是研究細胞程序性死亡機制的重要工具，其工作原理因不同技術路徑而異。
 

　　1.TUNEL技術
 

　　-核心機制：基于脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法。當細胞發(fā)生凋亡時，DNA內(nèi)切酶被激活并切割基因組DNA形成雙鏈或單鏈斷裂，產(chǎn)生大量具有粘性3'-OH末端的片段。此時，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶會將帶有熒光標記的dUTP連接到這些斷裂位點的3'羥基末端。
 

　　-信號可視化：在一步法操作中，反應混合液中的TdT酶與熒光染料共作用，使凋亡細胞呈現(xiàn)綠色、紅色等特定顏色的熒光信號；若采用顯色底物，則通過HRP催化DAB生成棕色沉淀實現(xiàn)光學顯微鏡下的觀察。正常細胞因DNA完整無斷裂位點，幾乎不產(chǎn)生標記信號。
 

　　2.Annexin V/PI檢測法
 

　　-磷脂酰絲氨酸外翻識別：凋亡早期，細胞膜表面的磷脂分布發(fā)生改變，原本位于內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸會暴露于細胞外側(cè)。利用依賴性的Annexin V蛋白可特異性結(jié)合該成分的特點，將其標記上熒光素。同時，碘化丙啶能夠嵌入壞死細胞破損的胞膜并染色DNA，從而實現(xiàn)對活細胞、凋亡細胞和壞死細胞的區(qū)分。
 

　　細胞凋亡檢測試劑盒的使用注意事項：
 

　　1.實驗操作規(guī)范性
 

　　-無菌操作：整個實驗過程應在無菌條件下進行，防止細菌污染影響實驗結(jié)果。所有使用的器材如移液器、離心管等都應經(jīng)過滅菌處理。
 

　　-動作輕柔：在處理細胞時動作要盡量輕柔，避免劇烈震蕩或機械損傷導致細胞破裂，從而釋放出胞內(nèi)成分干擾檢測結(jié)果。特別是在洗滌和重懸細胞的過程中，應緩慢加入液體并輕輕吹打混勻。
 

　　2.試劑質(zhì)量控制
 

　　-有效期檢查：使用前仔細查看試劑盒及其中各組分的有效期限，過期試劑可能會失效或變質(zhì)，影響實驗準確性。
 

　　-儲存條件遵循：嚴格按照說明書固定的溫度和環(huán)境保存試劑，某些試劑可能需要避光保存，如Annexin V -FITC對光敏感，長時間暴露于光線下會分解降低活性。
 

　　3.對照設置合理
 

　　-空白對照：設立不加任何處理因素且未經(jīng)染色的正常細胞作為空白對照，用于調(diào)整儀器參數(shù)和確定背景熒光水平。這有助于準確判斷陽性信號是否來自真實的凋亡事件。
 

　　-陽性對照：選用已知會發(fā)生凋亡的細胞株或經(jīng)過特定處理誘導凋亡的樣本作為陽性對照，驗證實驗系統(tǒng)的有效性和可靠性。例如，可以使用紫外線照射后的細胞作為陽性對照來確認試劑盒能夠正確檢測到凋亡信號。
 

　　4.樣本特性考量
 

　　-細胞類型差異：不同種類的細胞其表面抗原表達水平和膜通透性有所不同，可能會影響染色效果和檢測結(jié)果。因此，在初次使用該試劑盒檢測一種新的細胞類型時，建議先進行預實驗優(yōu)化條件。
 

　　-細胞密度適宜：上樣到流式細胞儀時的細胞密度不宜過高或過低。過高可能導致信號重疊難以區(qū)分單個細胞；過低則會延長數(shù)據(jù)采集時間且統(tǒng)計誤差增大。一般建議細胞濃度在一定范圍內(nèi)，如每毫升含有幾百萬個細胞左右。
 

　　5.數(shù)據(jù)分析謹慎性
 

　　-多次重復實驗：為了提高結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，每個樣本應至少進行三次獨立重復實驗，取平均值作為結(jié)果。這樣可以減少隨機誤差對結(jié)論的影響。
 

　　-結(jié)合其他方法驗證：雖然流式細胞術是一種常用的凋亡檢測方法，但也存在一定的局限性。可以結(jié)合形態(tài)學觀察(如光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化)、DNA片段化分析(瓊脂糖凝膠電泳檢測梯狀條帶)等其他方法綜合判斷細胞凋亡情況，以獲得更準確的信息。